Hola a todos.
Tengo una pregunta sobre un proyecto que estamos analizando, y que os resumo:
Hemos amplificado el promotor de un gen para ver su metilacion. Para eso hemos
hecho bisulfito y amplificacion con primers adaptados a los cambios de C a T.
Las PCRs han dado regulin, porque daban una banda de tamaño inferior muy
prominente en muchas muestras (pero no hubo manera de mejorarlo, eran primers
que venian de un paper y nos teniamos que ceñir a eso).
Para eliminar los productos de tamaño inferior lo filtre con Prinseq y
quedaron de cientos a miles de lecturas por muestra (hasta aqui todo OK, como
es un solo amplicon nos parece suficiente cobertura).
A continuacion hice un mapeo con Bowtie, usando un amplicon modificado (con
los cambios C a T a excepcion de 5 posibles islas CpG) aplicando las
condiciones Very Sensitive para que aceptara los cambios introducidos por el
bisulfito. Los % de mapeo son como del 50% que para una amplicon tan malo, lo
vemos bien tambien.
Para cuantificar la modificacion C a T de esas 5 islas CpG he usado VarScan2 y
ahi es donde me han surgido dudas.
Hice primero 3 muestras (nº 160 166 y 167) y una vez visto que todo corria
bien, ya hice todas (son casi 300).
Ahora vienen mis dudas /preguntas:
VarScan hace algun tipo de normalizacion de lecturas? (o se puede modificar si
lo hace?) Es que no me ha dado el mismo resultado cuando he analizado esas 3
muestras ellas solas que en el conjunto de las 300. No solo el % de
conversion, sino sobre todo la cobertura total y por alelo en cada posicion.
VarScan (SNPs) es una buena opcion para hacer esto?
En el servidor, dentro de la carpeta GemaDiaz_001-293 estan los datos del
piloto y de los mapeos y llamadas de variantes. Tambien del amplicon
modificado en formato fasta
Os adjunto las tablas de resumen de los resultados y en todo caso, como
entiendo que es un poco complicado, hablamos el lunes y os cuento mejor.
Muchas gracias como siempre por la ayuda
Ricardo
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